Применение бактериофагов в медицине и биотехнологии. Практическое применение фагов

Бактериофа ги или фа ги (от др. греч. φᾰγω «пожираю») - вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Чаще всего бактериофаги размножаются внутри бактерий и вызывают их лизис. Как правило, бактериофаг состоит из белковой оболочки и генетического материала одноцепочечной или двуцепочечной нуклеиновой кислоты(ДНК или, реже, РНК). Общая численность бактериофагов в природе примерно равна общей численности бактерий (1030 – 1032 частиц). Бактериофаги активно участвуют в круговороте химических веществ и энергии, оказывают заметное влияние на эволюцию микробов и бактерий Структура типичного миовируса бактериофага.

Строение бактериофагов 1 - головка, 2 - хвост, 3 - нуклеиновая кислота, 4 - капсид, 5 - «воротничок» , 6 - белковый чехол хвоста, 7 - фибрилла хвоста, 8 - шипы, 9 - базальная пластинка

Бактериофаги различаются по химической структуре, типу нуклеиновой кислоты, морфологии и характеру взаимодействия с бактериями. По размеру бактериальные вирусы в сотни и тысячи раз меньше микробных клеток. Типичная фаговая частица (вирион) состоит из головки и хвоста. Длина хвоста обычно в 2- 4 раза больше диаметра головки. В головке содержится генетический материал - одноцепочечная или двуцепочечная РНК или ДНК с ферментом транскриптазой в неактивном состоянии, окружённая белковой или липопротеиновой оболочкой - капсидом, сохраняющим геном вне клетки. Нуклеиновая кислота и капсид вместе составляют нуклеокапсид. Бактериофаги могут иметь икосаэдральный капсид, собранный из множества копий одного или двух специфичных белков. Обычно углы состоят из пентамеров белка, а опора каждой стороны из гексамеров того же или сходного белка. Более того, фаги по форме могут быть сферические, лимоновидные или плеоморфные. Хвост, или отросток, представляет собой белковую трубку - продолжение белковой оболочки головки, в основании хвоста имеется АТФаза, которая регенерирует энергию для инъекции генетического материала. Существуют также бактериофаги с коротким отростком, не имеющие отростка и нитевидные.

Систематика бактериофагов Большое количество выделенных и изученных бактериофагов определяет необходимость их систематизации. Этим занимается Международный комитет по таксономии вирусов (ICTV). В настоящее время, согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов, бактериофаги разделяют в зависимости от типа нуклеиновой кислоты и морфологии. На данный момент выделяют девятнадцать семейств. Из них только два РНКсодержащих и только пять семейств имеют оболочку. Из семейств ДНКсодержащих вирусов только два семейства имеют одноцепочечные геномы. У девяти ДНК-содержащих семейств геном представлен кольцевой ДНК, а у других девяти - линейной. Девять семейств специфичны только для бактерий, остальные девять только для архей, а (Tectiviridae) инфицирует как бактерий, так и архей

Взаимодействие бактериофага с бактериальными клетками По характеру взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой различают вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные фаги могут только увеличиваться в количестве посредством литического цикла. Процесс взаимодействия вирулентного бактериофага с клеткой складывается из нескольких стадий: адсорбции бактериофага на клетке, проникновения в клетку, биосинтеза компонентов фага и их сборки, выхода бактериофагов из клетки. Первоначально бактериофаги прикрепляются к фагоспецифическим рецепторам на поверхности бактериальной клетки. Хвост фага с помощью ферментов, находящихся на его конце (в основном лизоцима), локально растворяет оболочку клетки, сокращается и содержащаяся в головке ДНК инъецируется в клетку, при этом белковая оболочка бактериофага остаётся снаружи. Инъецированная ДНК вызывает полную перестройку метаболизма клетки: прекращается синтез бактериальной ДНК, РНК и белков. ДНК бактериофага начинает транскрибироваться с помощью собственного фермента транскриптазы, который после попадания в бактериальную клетку активируется. Синтезируются сначала ранние, а затем поздние и. РНК, которые поступают на рибосомы клетки-хозяина, где синтезируются ранние (ДНК-полимеразы, нуклеазы) и поздние (белки капсида и хвостового отростка, ферменты лизоцим, АТФаза и транскриптаза) белки бактериофага. Репликация ДНК бактериофага происходит по полуконсервативному механизму и осуществляется с участием собственных ДНК-полимераз. После синтеза поздних белков и завершения репликации ДНК наступает заключительный процесс - созревание фаговых частиц или соединение фаговой ДНК с белком оболочки и образование зрелых инфекционных фаговых частиц

Жизненный цикл Умеренные и вирулентные бактериофаги на начальных этапах взаимодействия с бактериальной клеткой имеют одинаковый цикл. Адсорбция бактериофага на фагоспецифических рецепторах клетки. Инъекция фаговой нуклеиновой кислоты в клетку хозяина. Совместная репликация фаговой и бактериальной нуклеиновой кислоты. Деление клетки. Далее бактериофаг может развиваться по двум моделям: лизогенный либо литический путь. Умеренные бактериофаги после деления находятся в состоянии профаза (лизогенный путь) Вирулентные бактериофаги развиваются по литической модели: Нуклеиновая кислота фага направляет синтез ферментов фага, используя для этого белоксинтезирующий аппарат бактерии. Фаг тем или иным способом инактивирует ДНК и РНК хозяина, а ферменты фага совсем расщепляют её; РНК фага «подчиняет» себе клеточный аппарат синтеза белка. Нуклеиновая кислота фага реплицируется и направляет синтез новых белков оболочки. Образуются новые частицы фага в результате спонтанной самосборки белковой оболочки (капсид) вокруг фаговой нуклеиновой кислоты; под контролем РНК фага синтезируется лизоцим. Лизис клетки: клетка лопается под воздействием лизоцима; высвобождается около 200- 1000 новых фагов; фаги инфицируют другие бактерии.

Применение В медицине Одной из областей использования бактериофагов является антибактериальная терапия, альтернативная приёму антибиотиков. Например, применяются бактериофаги: стрептококковый, стафилококковый, клебсиеллёзный, дизентерийныйиполив алентный, пиобактериофаг, коли, протейный и колипротейный и другие. В России зарегистрировано и применяется 13 медицинских препаратов на основе фагов. В настоящее время их применяют для лечения бактериальных инфекций, которые не чувствительны к традиционному лечению антибиотиками, особенно в республике Грузия. Обычно, применение бактериофагов сопровождается большим, чем антибиотики, успехом там, где присутствуют биологические мембраны, покрытые полисахаридами, через которые антибиотики обычно не проникают. В настоящее время терапевтическое применение бактериофагов не получило одобрения на Западе, хотя и применяются фаги для уничтожения бактерий, вызывающих пищевые отравления, таких, как листерии. В многолетнем опыте в объёме крупного города и сельской местности доказана необычайно высокая лечебная и профилактическая эффективность дизентерийного бактериофага (П. М. Лернер, 2010). В России терапевтические фаговые препараты делают давно, фагами лечили ещё до антибиотиков. В последние годы фаги широко использовали после наводнений в Крымске и Хабаровске, чтобы предотвратить дизентерию.

В биологии Бактериофаги применяются в генной инженерии в качестве векторов, переносящих участки ДНК, возможна также естественная передача генов между бактериями посредством некоторых фагов (трансдукция). Фаговые векторы обычно создают на базе умеренного бактериофага λ, содержащего двухцепочечную линейную молекулу ДНК. Левое и правое плечи фага имеют все гены, необходимые для литического цикла (репликации, размножения). Средняя часть генома бактериофага λ (содержит гены, контролирующие лизогению, то есть его интеграцию в ДНК бактериальной клетки) не существенна для его размножения и составляет примерно 25 тысяч пар нуклеотидов. Данная часть может быть заменена на чужеродный фрагмент ДНК. Такие модифицированные фаги проходят литический цикл, но лизогения не происходит. Векторы на основе бактериофага λ используют для клонирования фрагментов ДНК эукариот (то есть более крупных генов) размером до 23 тысяч пар нуклеотидов (т. п. н.). Причём, фаги без вставок - менее 38 т. п. н. или, напротив, со слишком большими вставками - более 52 т. п. н. не развиваются и не поражают бактерии. Поскольку размножение бактериофага возможно только в живых клетках, бактериофаги могут быть использованы для определения жизнеспособности бактерий. Данное направление имеет большие перспективы, поскольку, одним из основных вопросов при разных биотехнологических процессах является определение жизнеспособности используемых культур. С помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий была показана возможность изучения этапов взаимодействия фаг-микробная клетка

А также в ветеринарии для: профилактики и лечения бактериальных заболеваний птиц и животных; лечения гнойно-воспалительных заболеваний слизистых глаз, полости рта; профилактики гнойно-воспалительных осложнений при ожогах, ранениях, операционных вмешательствах; в генной инженерии: для трансдукции - естественной передачи генов между бактериями; как векторы, переносящие участки ДНК; с помощью фагов можно конструировать направленные изменения в геноме хозяйской ДНК; в пищевой промышленности: в массовом порядке фагосодержащими средствами уже обрабатывают готовые к употреблению продукты из мяса и домашней птицы; бактериофаги применяют в производстве продуктов питания из мяса, мяса птицы, сыров, растительной продукции, и пр. ;

в сельском хозяйстве: распыление фагопрепаратов для защиты растений и урожая от гниения и бактериальных заболеваний; для защиты скота и птицы от инфекций и бактериальных заболеваний; для экологической безопасности: антибактериальная обработка семян и растений; очистка помещений пищеперерабатывающих предприятий; санитарная обработка рабочего пространства и оборудования; профилактика помещений больниц; проведение экологических мероприятий

Таким образом, на сегодняшний день бактериофаги пользуются большой популярностью в жизни человека и животных. На предприятиях намечен целый ряд приоритетных направлений разработки и производства лечебнопрофилактических бактериофагов, которые коррелируют с вновь зарождающимися общемировыми тенденциями. Создаются и внедряются новые препараты, для лечения многих заболеваний . Изучением и применением бактериофагов занимаются бактериологи, вирусологи, биохимики, генетики, биофизики, молекулярные биологи, экспериментальные онкологи, специалисты по генной инженерии и биотехнологии

Набирает все больше поклонников среди врачей, отодвигая антибиотики на второй план. Когда-то появление антибиотиков полностью изменило представление врачей о лечении. Ранее безнадежные пациенты стали поправляться, предельно упростились алгоритмы лечения, резко упала смертность… Чудеса! Волшебные лекарства! Но восторженное отношение продержалось недолго. Слишком много проблем стало возникать.

Враг моего врага – мой друг

Сейчас «скользкие» вопросы антибиотикотерапии известны всем. Действие антибиотиков сопровождается:

Уничтожением необходимой, «полезной», микрофлоры кишечника и слизистых;

Активным ростом новых штаммов бактерий, устойчивых к ним;

Возникновением побочных эффектов за счет системного действия препаратов.

В связи с этим актуальным стал поиск принципиально иных лекарств для лечения бактериальных инфекций. И тут на первый план вышли бактериофаги.

Бактериофаги – это вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Вирус закрепляется на клеточной стенке бактерии и вводит внутрь клетки свой генетический материал. В результате начинается синтез новых вирусов, а затем происходят лизис бактериальной клетки и высвобождение 200-1000 новых фагов, которые инфицируют другие бактерии. Когда все бактерии патогенного штамма уничтожены, бактериофаги бесследно выводятся из организма. Многие бактериофаги узкоспецифичны, и каждый штамм вируса поражает только определенный вид бактерий, никак не влияя на прочие микроорганизмы и клетки организма. Это обеспечивает значительное уменьшение числа побочных эффектов.

Таким образом, к несомненным плюсам использования бактериофагов можно отнести:

Высокий профиль безопасности, позволяющий использовать их у пациентов любого возраста, начиная с новорожденных и заканчивая глубокими стариками;

Уменьшение риска возникновения устойчивых штаммов бактерий;

Возможность их сочетания с любыми другими препаратами, в том числе и антибиотиками.

Пожалуй, единственное, что ограничивает использование бактериофагов, – это их избирательность, из-за которой перед лечением необходимо уточнить природу возбудителя и его чувствительность к различным видам бактериофагов. Подобный анализ проводится отнюдь не везде и занимает определенное время, но усовершенствование диагностических систем позволяет надеяться, что эта проблема в скором времени может быть разрешена.

От теории – к практике

Существуют разные виды бактериофагов: монофаги, направленные на уничтожение только одного вида бактерий, и полифаги, действующие сразу на несколько видов патогенных бактерий. Поскольку бактериофаги чрезвычайно востребованы практически во всех областях медицины, от хирургии и гинекологии до неонатологии и ЛОР-практики, то предусмотрен выпуск бактериофагов в различных формах. Их используют для приема внутрь рег оs, в виде клизм, аппликаций, орошений, для введения в полости ран, влагалища, матки, носа, пазух носа, а также для введения в дренированные полости – брюшную, плевральную, мочевого пузыря, почечной лоханки. Продолжительность курса зависит от клинических показаний и может составить 7-20 дней. Безопасные, эффективные и надежные бактериофаги – это именно то оружие, которое так необходимо в борьбе с патогенными бактериями.

Не только лекарство

Прогресс в молекулярной биологии и биотехнологиях позволил использовать бактериофаги не только для лечения, но и для других целей. В США, например, бактериофаги применяют в качестве безопасного консерванта для пищевых продуктов. Добавленные к продуктам, бактериофаги препятствуют размножению нежелательных бактерий.

Интересные факты

Открытие бактериофагов произошло в 1894 году, когда британский бактериолог Эрнест Ханкин заметил, что индийских рек Ганг и Джамна обладает значительной антибактериальной активностью, которая полностью исчезает после кипячения. Он предположил, что в воде присутствует некая субстанция, убивающая бактерии. Название «бактериофаг» («поедатель бактерий») эти вирусы получили в 1917 году от французского ученого Феликса Д’ Эрелля, открывшего «невидимого микроба, поражающего дизентерийную палочку». Уточнение природы этого «невидимки» стало возможным только после появления электронной микроскопии.

Практическое применение фагов. Бактерио­фаги используют в лабораторной диагнос­тике инфекций при внутривидовой иденти­фикации бактерий, т. е. определении фаговара (фаготипа). Для этого применяют метод фаготипирования, основанный на строгой специфичности действия фагов: на чашку с плотной питательной средой, засеянной «газоном» чистой культурой возбудителя, на­носят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Фаговар бактерии определяется тем типом фага, ко­торый вызвал ее лизис (образование сте­рильного пятна, «бляшки», или «негативной колонии», фага). Методику фаготипирова­ния используют для выявления источника и путей распространения инфекции (эпидеми­ологическое маркирование). Выделение бак­терий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения.

Фаги применяют также для лечения и про­филактики ряда бактериальных инфекций. Производят брюшнотифозный, сальмонеллезный, дизентерийный, синегнойный, ста­филококковый, стрептококковый фаги и комбинированные препараты (колипротейный, пиобактериофаги и др). Бактериофаги назначают по показаниям перорально, парен­терально или местно в виде жидких, таблети-рованных форм, свечей или аэрозолей.

Бактериофаги широко применяют в генной инженерии и биотехнологии в качестве векторов для получе­ния рекомбинантных ДНК.

Возбудители эшерихиозов. Таксономия и характеристика. Роль кишечной палочки в норме и патологии. Микробиологическая диагностика энтеральных эшерихиозов. Принципы лечения и профилактики.

Эшерихиозы - инфекционные болезни, возбудителем которых является Escherichia coli.

Различают энтеральные (кишечные) и паренте­ральные эшерихиозы. Энтеральные эшерихиозы - острые инфек­ционные болезни, характеризующиеся преимущественным пора­жением ЖКТ. Они протекают в виде вспышек, возбудителями являются диареегенные штаммы E.coli. Парентеральные эшерихи­озы - болезни, вызываемые условно-патогенными штаммами E.coli - представителями нормальной микрофлоры толстой киш­ки. При этих болезнях возможно поражение любых органов.

Таксономическое положение . Возбудитель - кишеч­ная палочка - основной представитель рода Escherichia, семей­ства Enterobacteriaceae, относящегося к отделу Gracilicutes.

Морфологические и тинкториальные свойства . E.coli - это мелкие грамотрицательные палочки с закругленными концами. В мазках они располагаются беспорядочно, не образуют спор, перитрихи. Некоторые штаммы имеют микрокапсулу, пили.

Культуральные свойства. Кишечная палочка - факультативный анаэроб, оптим. темп. для роста - 37С. E.coli не требовательна к питательным средам и хоро­шо растет на простых средах, давая диффузное помутнение на жидких и образуя колонии на плотных сре­дах. Для диагностики эшерихиозов используют дифференциально-диагности­ческие среды с лактозой - Эндо, Левина.

Ферментативная ак­тивность. E.coli обладает большим набором различных ферментов. Наиболее отличительным признаком E.coli является ее способность ферментировать лактозу.

Антигенная структура . Кишечная палочка обладает со­матическим О-, жгутиковым Н и поверхностным К -антигена­ми. О-антиген имеет более 170 вариантов, К-антиген - более 100, Н-антиген - более 50. Строение О-антигена определяет принадлежность к серогруппе. Штаммы E.coli, имеющие присущий им набор антигенов (ан­тигенную формулу), называются серологическими вариантами (серовары).

По антигенным, токсигенным, свойствам разли­чают два биологических варианта E.coli:

1) условно-патоген­ные кишечные палочки;

2) «безусловно» патогенные, диареегенные.

Факторы патогенности . Образует эндотоксин, обладающий энтеротропным, нейротропным и пирогенным действием. Диареегенные эшерихии продуцируют эк­зотоксин вызывающий значительное на­рушение водно-солевого обмена. Кроме того, у некоторых штам­мов, как и возбудителей дизентерии, обнаруживается инвазивный фактор, способствующий проникновению бактерий внутрь клеток. Патогенность диареегенных эшерихии - в возникновении геморрагии, в нефро-токсическом действии. К факторам патогенности всех штам­мов E.coli относятся пили и белки наружной мембраны, способствующие адгезии, а также микрокапсула, препятству­ющая фагоцитозу.

Резистентность. E.coli от­личается более высокой устойчивостью к действию различных факторов внешней среды; она чувствительна к дезинфектантам, быстро погибает при кипячении.

Роль E.coli . Кишечная палочка - представитель нормаль­ной микрофлоры толстой кишки. Она является антагонистом патогенных кишечных бак­терий, гнилостных бактерий и грибов рода Candida. Кроме того, она участвует в синтезе витаминов группы В, Е и К, частично расщепляет клетчатку.

Штаммы, обитающие в толстой кишке и являющиеся условно-патогенны­ми, могут попасть за пределы ЖКТ и при снижении иммуни­тета и их накоплении стать причиной различных неспецифичес­ких гнойно-воспалительных болезней (циститов, холециститов) - парентеральных эшерихиозов.

Эпидемиология. Источник энтеральных эшерихиозов - больные люди. Механизм заражения - фекально-оральный, пути передачи- алиментарный, контактно-бытовой.

Патогенез. Полость рта.Попадает в тонкую кишку, адсорбируется в клетках эпителия с помощью пилей и белков наружной мембраны. Бактерии размножаются, погибают, осво­бождая эндотоксин, который усиливает перистальтику кишеч­ника, вызывает диарею, повышение температуры тела и другие симптомы общей интоксикации. Выделяет экзотоксин - тяжелая диарея, рвоту и значительное нарушение водно-солевого обмена.

Клиника. Инкубационный период составляет 4 дн. Бо­лезнь начинается остро, с повышения температуры тела, болей в животе, поноса, рвоты. Отмечаются нарушение сна и аппе­тита, головная боль. При геморрагической форме в кале обнаружи­вают кровь.

Иммунитет. После перенесенной болезни иммунитет не­прочный и непродолжительный.

Микробиологическая диагностика . Основной метод - бак­териологический. Определяют вид чистой культуры (грамотрицательные палочки, оксидазоотрицательные, ферментирующие глю­козу и лактозу до кислоты и газа, образующие индол, не образую­щие сероводород) и принадлежность к серогруппе, что позволяет, отличить условно-патогенные кишечные палочки от диареегенных. Внутривидовая идентификация, имеющая эпидемиологичес­кое значение, заключается в определении серовара с помощью диагностических адсорбированных иммунных сывороток.

83. Структура и функции иммунной системы.

Отличительные свойства бактериофагов как представителей царства Vira. Вирулентные фаги, стадии взаимодействия с бактериальной клеткой. Практическое применение бактериофагов

Вирулентные фаги вызывают продуктивную инфекцию , при которой происходит репродукция фагов и лизис бактериальной клетки.

Механизм взаимодействия вирулентного фага с микробной клеткой:

1. Адсорбция фага на чувствительной клетке. Происходит при наличии комплементраных рецепторов в клеточной стенке бактерий и на концах нитей фагового отростка. Сперва фаг присоединяется нитями, а затем прочно прикрепляется к клеточной стенке с помощью зубцов банальной пластинки.

2. Проникновение ДНК фага в бактериальную клетку . С помощью лизоцима, находящегося в банальной пластинке, участок клеточной стенки гидролизируется, чехол отростка сокращается и внутренний стержень прокалывать оболочки клетки. Молекула фаговой ДНК по каналу стержня проникает внутрь клетки.

3. Внутриклеточное развитие фага . Фазовая ДНК вносит в бактериальную клетку генетическую информацию. Происходит биосинтез компонентов, необходимых для репродукции. На начальных этапах синтезируются "ранние белки" - ферменты, осуществляющие репликацию фаговой ДНК с целью образования множества ее копий. Затем на клеточных рибосомах формируются структурные "поздние белки"

4. Морфогенез фага . Созревание фага происходит по трем независимым ветвям в различных участках клетки, является разобщенным процессом. Отдельно формируются головки фага - вокруг молекулы ДНК строится капсид. Независимо идет построение отростка. Отдельно синтезируются нити отростка. Затем все составные части фага объединяются, образуя вирионы.

5. Лизис бактериальной клетки и выход фага. Лизис осуществляется под действием лизоцима. Выход путем отпочковывания.

Строгая специфичность бактериофагов позволяет использовать их для фаготипирования и дифференцировки бактериальных культур, а также для индикации их во внешней среде, например в водоемах.

Метод фаготипирования бактерий широко применяется в микробиологической практике. Он позволяет не только определить видовую принадлежность исследуемой культуры, но и ее фаготип (фаговар). Это связано с тем, что у бактерий одного и того же вида имеются рецепторы, адсорбирующие строго определенные фаги, которые затем вызывают их лизис. Использование наборов таких типоспецифических фагов позволяет проводить фаготипирование исследуемых культур с целью эпидемиологического анализа инфекционных заболеваний:(установления источника инфекции и путей ее передачи)

II. Фаги применяют для профилактики и лечения инфекционных заболеваний:

а) фагопрофилактика - метод предупреждения развития некоторых бактериальных инфекций с помощью приема внутрь специфического бактериофага. Применяют для профилактики холеры, дизентерии, брюшного тифа и др.

б) фаготерапия- метод лечения бактериальных инфекций посредством приема внутрь специфического фага. (брюшнотифозного, сальмонеллезных, дизентерийного, протейного, синегнойного, стафилококкового, стрептококкового, коли-фага и комбинированных препаратов. Их используют в терапии инфекционных заболеваний, вызываемых вышеперечисленными микроорганизмами, а также в терапии раневых и анаэробных инфекций.)

Генотипическая изменчивость

Патогенность -

Адгезия

Инвазия

Агрессия .

4.Строение генетического аппарата прокариот. Фенотипическая и генотипическая изменчивость. Генетические основы патогенности бактерий.

Генетический аппарат прокариот - не имеет ядерной оболочки и представлен одной кольцевой молекулой ДНК,которая является хромосомой; располагается в цитоплазме,не содержит белков гистонов. Не способен к митозу

Фенотипическая изменчивость – модификации(изменение не одного или нескольких признаков)– не затрагивает генотип. Изменения Фенотипическая происходят под влиянием факторов внешней среды.Модификации затрагивают большинство особей в популяции. Они не передаются по наследству и с течением времени затухают, т. е. возвращаются к исходному фенотипу.

Генотипическая изменчивость - изменение свойств бактерий,застрагивая их генотип. Передается по наследству, является долговременной. Возникает в следствие мутаций или генетического обмена(трансформации, конъюгации или трансдукции)

Патогенность - видовой признак, передающийся по наследству, закрепленный в геноме микроорганизма т. е. это генотипический признак, отражающий потенциальную возможность микроорганизма проникать в макроорганизм и размножаться в нем (инвазионность), вызывать комплекс патологических процессов, возникающих при заболевании.

К факторам патогенности относят способность микроорганизмов прикрепляться к клеткам (адгезия), размещаться на их поверхности (колонизация), проникать в клетки (инвазия) и противостоять факторам защиты организма (агрессия).

Часть из них кодируется непосредственно генами нуклеоида (например, капсула и ферменты у некоторых видов). Другая часть кодируется внехромосомными факторами наследственности – плазмидами и эписомами. Плазмидные гены обычно определяют взаимодействие возбудителей с эпителием, а хромосомные – существование и размножение бактерий внеклеточно в органах и тканях.

Адгезия Структуры, ответственные за связывание микроорганизма с клеткой называются адгезинами и располагаются они на его поверхности.У грамотрицательных бактерий адгезия происходит за счет пилей I и общего типов. У грамположительных бактерий адгезины представляют собой белки и тейхоевые кислоты клеточной стенки. У других микроорганизмов эту функцию выполняют различные структуры клеточной системы: поверхностные белки, липополисахариды, и др.

Инвазия фермент гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав межклеточного вещества, и, таким образом, повышает проницаемость слизистых оболочек и соединительной ткани. Нейраминидаза расщепляет нейраминовую кислоту, которая входит в состав поверхностных рецепторов клеток слизистых оболочек, что способствует проникновению возбудителя в ткани.

Агрессия К факторам агрессии относятся: протеазы - ферменты, разрушающие иммуноглобулины; коагулаза - фермент, свертывающий плазму крови; фибринолизин - растворяющий сгусток фибрина; лецитиназа - фермент, действующий на фосфолипиды мембран мышечных волокон, эритроцитов и других клеток.

Практическое применение фагов. Бактерио­фаги используют в лабораторной диагнос­тике инфекций при внутривидовой иденти­фикации бактерий, т. е. определении фаговара (фаготипа). Для этого применяют метод фаготипирования, основанный на строгой специфичности действия фагов: на чашку с плотной питательной средой, засеянной «газоном» чистой культурой возбудителя, на­носят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Фаговар бактерии определяется тем типом фага, ко­торый вызвал ее лизис (образование сте­рильного пятна, «бляшки», или «негативной колонии», фага). Методику фаготипирова­ния используют для выявления источника и путей распространения инфекции (эпидеми­ологическое маркирование). Выделение бак­терий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения.

Фаги применяют также для лечения и про­филактики ряда бактериальных инфекций. Производят брюшнотифозный, сальмонеллезный, дизентерийный, синегнойный, ста­филококковый, стрептококковый фаги и комбинированные препараты (колипротейный, пиобактериофаги и др.). Бактериофаги назначают по показаниям перорально, парен­терально или местно в виде жидких, таблетированных форм, свечей или аэрозолей.

Бактериофаги широко применяют в генной инженерии и биотехнологии в качестве векторов для получе­ния рекомбинантных ДНК.

Применяемые на практике препараты бактериофагов представляют собой фильтрат бульонной культуры соответствующих микробов, лизированных фагом, содержащий живые частицы фага, а также растворённые антигены бактерий, освободившиеся из бактериальных клеток при их лизисе. Полученный препарат - жидкий бактериофаг должен иметь вид совершенно прозрачной жидкости жёлтого цвета большей или меньшей интенсивности.

Для применения с лечебно-профилактическими целями фаги могут выпускаться в форме таблеток с кислотоустойчивой оболочкой. Таблетированный сухой фаг более стабилен при хранении и удобен при применении. Одна таблетка сухого бактериофага соответствует 20-25 мл жидкого препарата. Срок годности сухого и жидкого препарата - 1 год. Жидкий бактериофаг следует хранить при температуре + 2 +10 С, сухой- не выше +1°С, но его можно хранить в холодильнике и при отрицательной температуре.

Принятый внутрь бактериофаг сохраняется в организме в течение 5-7 дней. Как правило, прием бактериофага не сопровождается какими-либо реакциями или осложнениями. Противопоказаний к приёму нет. Применяются в виде орошений, полосканий, примочек, тампонов, инъекций, а также вводят в полости - брюшную, плевральную, суставную и в мочевой пузырь, в зависимости от места локализации возбудителя.

Диагностические фаги выпускаются как в жидкой, так и сухой форме в ампулах.Перед началом работы сухой бактериофаг разводится. Если на ампулах указан титр,тр, ДРТ (доза рабочего титра) применяют в реакции фаголизабельности (метод Отто) для идентификации бактерий, если указан тип фага, то для фаготипирования– определения источника инфекции.

Действие бактериофага на микробную культуру в жидкой среде и на плотной среде

Метод Отто (стекающая капля)

Делают густой посев газоном исследуемой культуры. Через 5-10 мин после посева на подсушенную поверхность питательной среды наносят жидкий диагностический фаг. Чашку слегка наклоняют, чтобы капля фага растеклась по поверхности агара. Чашку помещают в термостат на 18-24 часа. Учёт результата производят по полному отсутствию роста культуры в месте нанесения капли фага.

Опыт на жидкой питательной среде

Делают посев исследуемой культуры в две пробирки с жидкой средой. В одну пробирку («О») добавляют петлёй диагностический бактериофаг. Через 18-20 часов в пробирке, куда бактериофаг не добавлялся («К»), наблюдается сильное помутнение бульона - произошел рост посеянной культуры. Бульон в пробирке, куда был добавлен бактериофаг, остался прозрачным вследствие лизиса культуры под его влиянием.

Фаготипирование бактерий

По спектру действия различают следующие бактериофаги: поливалентные, лизирующие родственные виды бактерий; моновалентные, лизирующие бактерии определенного вида; типовые, лизирующие отдельные типы (варианты) бактерий.

Например, один штамм патогенного стафилококка может лизироваться несколькими типами фагов, поэтому все типовые фаги (24) и штаммы патогенных стафилококков объединены в 4 группы.

Метод фаготипирования имеет большое значение для эпидемиологического исследования, так как позволяет выявить источник и пути распространения возбудителей заболеваний. С этой целью определяют фаговар выделенной из патологического материала чистой культуры на плотных питательных средах с помощью типовых диагностических фагов.

Фаговар культуры микроорганизмов определяют по тому типовому фагу, который вызвал ее лизис.Выделение бактерий одного фаговара от разных обследуемых указывает на источник заражения.